微生物生長曲線系統(tǒng)評估黑曲霉孢子在不同銅離子濃度下的生長情況
研究背景：真菌污染在各種工業(yè)和環(huán)境環(huán)境中仍然是一個(gè)持續(xù)的挑戰(zhàn)。表明真菌感染和霉菌傳播帶來的威脅越來越大，無論是在數(shù)量還是嚴(yán)重程度方面。為了減輕這種風(fēng)險(xiǎn)，必須制定和實(shí)施有效的預(yù)防策略，旨在抑制真菌孢子的傳播和生長，特別是在臨床環(huán)境和狹窄建筑空間等關(guān)鍵環(huán)境中。近年來由于絲狀真菌對不斷變化的環(huán)境條件的適應(yīng)性，越來越被認(rèn)為是人類健康和農(nóng)業(yè)的主要問題。最近的研究進(jìn)一步表明，尤其是全球變暖正在改變絲狀真菌和酵母的耐熱性。本研究聚焦于黑曲霉孢子對銅表面的應(yīng)激反應(yīng)及其對抗霉表面功能化的影響。真菌污染在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)和工業(yè)領(lǐng)域是一個(gè)持續(xù)存在的挑戰(zhàn)，因?yàn)檎婢哂泻軓?qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和對殺菌劑的抗性。
為了應(yīng)對這一問題，研究者們利用超短脈沖激光誘導(dǎo)的周期性表面結(jié)構(gòu)（USP-DLIP）技術(shù)，對銅、黃銅和鋼表面進(jìn)行功能化處理，設(shè)計(jì)了3微米和9微米的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，以評估其抗真菌效果。研究方法包括銅離子釋放量的測量、掃描電子顯微鏡（SEM）分析、濕接觸殺滅實(shí)驗(yàn)以及代謝活性測試。結(jié)果顯示，9微米周期的銅表面結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)99%的孢子活性降低，表明銅離子釋放增加是增強(qiáng)抗真菌效果的關(guān)鍵因素。SEM分析確認(rèn)了孢子在銅表面的顯著損傷，而鋼表面的孢子則相對完整。代謝活性測試表明，接觸過銅、黃銅和鋼表面的孢子顯示出更快的代謝活性恢復(fù)。此外9微米結(jié)構(gòu)的銅表面在抗真菌效果上優(yōu)于3微米結(jié)構(gòu)，而黃銅和鋼表面的抗真菌效果不顯著。
研究結(jié)論指出，USP-DLIP技術(shù)處理的銅表面在抗真菌方面表現(xiàn)出顯著效果，特別是9微米結(jié)構(gòu)的銅表面能夠顯著降低黑曲霉孢子的活性。增加表面結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性可以提高銅離子的釋放量，從而增強(qiáng)抗真菌效果。盡管黃銅和鋼表面也經(jīng)過了USP-DLIP處理，但它們的抗真菌效果不明顯，這可能與銅離子的釋放量和真菌對金屬離子的耐受性有關(guān)。研究還強(qiáng)調(diào)了銅表面在實(shí)際應(yīng)用中的長期穩(wěn)定性和耐腐蝕性需要進(jìn)一步研究。
丹麥Biosense微生物生長曲線監(jiān)測系統(tǒng)的應(yīng)用
oCelloScope是一種自動(dòng)化微生物成像設(shè)備，用于評估黑曲霉（Aspergillus niger）孢子在不同銅離子濃度下的生長情況。oCelloScope通過定期拍攝孢子的生長情況，生成高分辨率的顯微圖像。這些圖像用于觀察孢子的萌發(fā)、菌絲生長以及形態(tài)變化。通過設(shè)備內(nèi)置的SESA（Segmentation and Extraction of Surface Areas）算法能夠自動(dòng)分析孢子的生長曲線。通過計(jì)算孢子在不同時(shí)間點(diǎn)的生長面積。oCelloScope能夠在長達(dá)30小時(shí)的實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)監(jiān)測孢子的生長情況，每隔30分鐘拍攝一次圖像。這種長時(shí)間的監(jiān)測能力使得研究者能夠全面了解孢子在不同銅離子濃度下的生長動(dòng)態(tài)。將黑曲霉孢子暴露于不同濃度的CuSO?溶液中，然后將這些孢子轉(zhuǎn)移到含有最小培養(yǎng)基（MM）的96孔板中。使用oCelloScope拍攝孢子在30°C下培養(yǎng)30小時(shí)的生長情況。通過分析孢子的萌發(fā)和菌絲生長，發(fā)現(xiàn)隨著銅離子濃度的增加，孢子的生長受到顯著抑制。oCelloScope的自動(dòng)化成像和分析功能大大提高了實(shí)驗(yàn)效率，減少了人為操作的誤差。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
通過實(shí)驗(yàn)評估了超短脈沖激光誘導(dǎo)的周期性表面結(jié)構(gòu)（USP-DLIP）對銅、黃銅和鋼表面的抗真菌功能化效果，特別是針對黑曲霉（Aspergillus niger）孢子的應(yīng)激反應(yīng)。9微米周期的銅表面結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)99%的孢子活性降低，表明銅離子釋放增加是增強(qiáng)抗真菌效果的關(guān)鍵因素。SEM分析顯示，銅表面的孢子出現(xiàn)顯著的細(xì)胞壁破裂和形態(tài)塌陷，而鋼表面的孢子則相對完整。增加表面結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性（如9微米結(jié)構(gòu)）可以提高銅離子的釋放量，從而增強(qiáng)抗真菌效果。3微米和9微米結(jié)構(gòu)的銅表面在抗真菌效果上存在顯著差異，9微米結(jié)構(gòu)表現(xiàn)更優(yōu)。銅表面在實(shí)驗(yàn)室條件下表現(xiàn)出良好的抗真菌效果，但在實(shí)際應(yīng)用中，其長期穩(wěn)定性和耐腐蝕性需要進(jìn)一步研究。真菌（如黑曲霉）可能通過產(chǎn)生草酸等代謝產(chǎn)物加速銅表面的腐蝕，這可能影響銅表面的長期抗真菌效果。
圖1、銅表面對微生物物種抗菌作用的簡化方案，這里是真菌細(xì)胞的示例。A，B）銅離子從銅表面溶解并進(jìn)入微生物（真菌細(xì)胞）壁和膜。通過與嵌入膜中的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的直接相互作用或通過被動(dòng)機(jī)制（如跨膜的電化學(xué)梯度）進(jìn)行主動(dòng)運(yùn)輸，導(dǎo)致膜電位和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物的損失。銅離子在細(xì)胞內(nèi)的積累必須達(dá)到一定的閾值才會變得有毒，這個(gè)閾值因生物體而異。C）不同的銅種類通過Fenton樣反應(yīng)誘導(dǎo)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，基因組和質(zhì)粒DNA降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
圖2、在30°C（終點(diǎn)）下孵育30小時(shí)后，所有測試的CuSO4濃度（10×10、20×10、30×10、40×10、50×10m）以及兩種菌株的未處理對照。比例尺對應(yīng)于50μm
圖3、以SESAfun規(guī)范[a.u].對應(yīng)于A）野生型菌株和B）色素沉著突變菌株隨時(shí)間變化的真菌質(zhì)量。陽性（未處理的）真菌孢子顯示為綠色。
圖4、A）A.niger野生型N402孢子和B）A.niger色素沉著突變菌株（MA 93.1）在與相應(yīng)的功能化表面接觸30、60和120分鐘后的存活數(shù)據(jù)。存活分?jǐn)?shù)（N/N0）是相對于未暴露的孢子計(jì)算的（與金屬表面沒有任何接觸的初始孢子濃度）。
圖5、與結(jié)構(gòu)化（3μm）銅、黃銅和鋼以及未經(jīng)處理的孢子接觸后，孢子生長和發(fā)芽過程中代謝活性的發(fā)育，沒有任何金屬表面接觸。代謝活性測量為A）A.niger野生型N402孢子和B）A.niger色素沉著突變菌株（MA 93.1）與3μm USP-DLIP功能化表面接觸120分鐘后刃天青（%）的相應(yīng)減少。將陽性對照的代謝速率與處理過的孢子進(jìn)行比較，觀察到以下顯著性：A）鋼3μm（p=0.010）、銅3μm（p=0.0007）和黃銅3μm（p=0.0006）。數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（n=3）。值得注意的是，在野生型孢子（p=0.03）的12小時(shí)時(shí)觀察到鋼和銅表面之間的特異性顯著差異，盡管由于隨著時(shí)間的推移重疊的代謝趨勢，這種差異很難可視化。B）鋼3μm（p=0.006），銅3μm（p=0.010）和黃銅3μm（p=0.004）。
總結(jié)
USP-DLIP結(jié)構(gòu)化銅表面顯著增強(qiáng)了抗真菌功效，特別是針對野生型菌株，其中9μm結(jié)構(gòu)導(dǎo)致真菌孢子活力顯著降低。這凸顯了表面結(jié)構(gòu)作為開發(fā)先進(jìn)抗菌材料的強(qiáng)大策略的潛力。研究結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)化地形會影響真菌活力，即使在非抗菌材料上也是如此，如在鋼表面上觀察到的輕微抗真菌效果所示。相比之下，黃銅表面的真菌活力沒有表現(xiàn)出類似的降低，這可能是由于有毒銅離子的生物利用度有限和鋅的同步釋放，真菌可能會將其用作微量營養(yǎng)素，而不是將其作為壓力源。
oCelloScope是一種自動(dòng)化微生物成像設(shè)備，用于評估黑曲霉（Aspergillus niger）孢子在不同銅離子濃度下的生長情況，為研究黑曲霉孢子對銅離子的耐受性提供了有力的支持。oCelloScope通過定期拍攝孢子的生長情況，生成高分辨率的顯微圖像。這些圖像用于觀察孢子的萌發(fā)、菌絲生長以及形態(tài)變化。oCelloScope能夠在長達(dá)30小時(shí)的實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)監(jiān)測孢子的生長情況，每隔30分鐘拍攝一次圖像。這種長時(shí)間的監(jiān)測能力使得研究者能夠全面了解孢子在不同銅離子濃度下的生長動(dòng)態(tài)。
此外鋅與銅的吸收競爭及其在草酸鹽復(fù)合物形成中的作用可能會進(jìn)一步減輕銅的毒性，從而有助于在黃銅表面觀察到的抗真菌作用減弱。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了材料成分和表面結(jié)構(gòu)在優(yōu)化抗真菌表面設(shè)計(jì)中的重要性。精確的表面修飾可以顯著增強(qiáng)抗真菌活性，但在真菌恢復(fù)力和對銅基抗菌表面的適應(yīng)性方面仍然存在很大的知識差距。此外USP-DLIP結(jié)構(gòu)在實(shí)際應(yīng)用中的長期耐久性需要進(jìn)一步研究，尤其是在材料老化和暴露于實(shí)際污染物（如汗液、唾液和有機(jī)殘留物）的情況下。本研究為開發(fā)新型銅基抗真菌材料提供了重要見解，并評估了銅和銅合金表面的抗真菌潛力。這些發(fā)現(xiàn)對于設(shè)計(jì)和優(yōu)化抗真菌表面具有重要意義，尤其是在醫(yī)療、工業(yè)和空間探索等領(lǐng)域。
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