產(chǎn)脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件研究（三）
2結(jié)果
2.1產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選
從羅丹明B初篩固體培養(yǎng)基上篩選得到10株水解圈較大的菌株，這些菌株在350 nm紫外燈下觀察，在菌落周圍均有明顯的橙黃色熒光圈（圖1）。重復(fù)3次搖瓶發(fā)酵后，10株菌的產(chǎn)脂肪酶活性存在一定的差異（表1），其中菌株LD-1302的產(chǎn)脂肪酶活性最高，酶活達（22.58±0.09）U/mL。發(fā)酵24 h后，LD-1302培養(yǎng)基表面存在不溶于水且浮在水面的絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)，48 h后該絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)消失。
圖1 350 nm紫外燈下產(chǎn)脂肪酶菌落周圍的橙黃色熒光圈
表1 10株產(chǎn)脂肪酶菌株的酶活
2.2菌株鑒定結(jié)果
2.2.1菌落形態(tài)及鏡檢
LD-1302菌落形狀不規(guī)則、凸面、白色不透明、邊緣為毛發(fā)狀；革蘭氏染色鏡檢呈紫色，為G+菌；芽孢染色鏡檢可觀察到綠色的芽孢、顯紅色的營養(yǎng)體。
2.2.216S rDNA序列測定與分析
以菌株LD-1302的DNA為模版，經(jīng)細菌16SrDNA通用引物擴增獲得序列長度為1 512 bp的基因片段，對其測序并提交Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫。同源性分析結(jié)果表明，菌株LD-1302的16S rDNA基因序列與Genbank中的BCRC 15413等15株芽孢桿菌屬細菌的同源性達99.9%以上，利用MEGA 6.1構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明該菌株與地衣芽孢桿菌B.licheniformis聚為一支（圖2）。初步鑒定菌株LD-1302為地衣芽孢桿菌。
2.2.3生理生化鑒定
菌株LD-1302可于55℃下生長、淀粉水解試驗菌落四周出現(xiàn)無色透明圈、明膠水解培養(yǎng)基出現(xiàn)液化現(xiàn)象、V-P試驗培養(yǎng)基顯紅色、V-P試驗培養(yǎng)基的終pH顯酸性、檸檬酸鹽及丙酸鹽培養(yǎng)基顯藍色、均可在NaCl 5%、NaCl 7%的肉湯培養(yǎng)基中生長、在pH5.7、pH6.8的肉湯培養(yǎng)基中生長良好，符合對地衣芽孢桿菌的描述（東秀珠等，2001）。結(jié)合革蘭氏染色、芽孢染色及16S rDNA序列測定與分析結(jié)果，鑒定菌株LD-1302為地衣芽孢桿菌。
圖2菌株LD-1302的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹
2.3活菌總數(shù)計數(shù)
地衣芽孢桿菌LD-1302在以橄欖油為唯一碳源的生長培養(yǎng)基中延滯期較短，培養(yǎng)6 h活菌總數(shù)達到最高，為（94.67±3.21）×106CFU/mL，LD-1302在6～20 h內(nèi)生長較為穩(wěn)定，表明該菌株可利用有機碳源橄欖油，并在6 h時將培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)基本消耗殆盡（圖3）。
圖3菌株LD-1302的生長曲線
2.4接種量對LD-1302產(chǎn)酶活性的優(yōu)化
由圖4可知：以橄欖油為碳源時，菌株LD-1302的最適接種量為1.50%，即菌株起始接種濃度為3.75×105CFU/mL時，產(chǎn)脂肪酶活性最高，酶活可達到（31.64±0.34）U/mL，且在最少接種濃度為1.25×105CFU/mL時，也存在較高的產(chǎn)脂肪酶活性。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)可知：接種量P=0.00<0.01、時間P=0.001<0.01，表明接種量、時間均對酶活影響極顯著；由接種量-酶活的同類子集結(jié)果可知：接種量為0.50%、2.50%時，酶活均值分別為15.35 U/mL、17.87 U/mL，在同一子集中，表明兩者對產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異；接種量為1.00%、2.00%時，酶活均值分別為20.68 U/mL、19.02 U/mL，在同一子集中，表明兩者對產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，但產(chǎn)酶效果優(yōu)于前兩者；接種量為1.50%時，酶活均值為26.53 U/mL，與前四者分屬不同子集，表明為接種量為1.50%時，產(chǎn)脂肪酶效果最好；由時間-酶活的同類子集結(jié)果可知：72 h時，酶活均值為17.72 U/mL，24 h、48 h時，酶活均值分別為21.35 U/mL、20.60 U/mL，在同一子集中，表明兩者對產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，但產(chǎn)脂肪酶活優(yōu)于前者。
2.5碳源對LD-1302產(chǎn)酶活性的影響
圖4接種量對LD-1302利用橄欖油產(chǎn)脂肪酶的影
由圖5可知：最適接種量的LD-1302經(jīng)橄欖油、椰子油、葵花籽油誘導(dǎo)，最高產(chǎn)脂肪酶活分別為（23.42±0.84）U/mL、（10.76±0.51）U/mL、（9.77±0.51）U/mL。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)可知：碳源、時間的P=0.00<0.01，表明碳源、時間均對酶活影響極顯著；由碳源-酶活的同類子集結(jié)果可知：以椰子油、葵花籽油為碳源時，酶活均值均為8.51 U/mL，在同一子集中，表明兩者對產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，而以橄欖油為碳源時，酶活均值為17.54 U/mL，與椰子油、葵花籽油分屬不同子集，表明以橄欖油為碳源時，產(chǎn)脂肪酶效果最好；由時間-酶活的同類子集結(jié)果可知：24 h、72 h時，酶活均值分別為10.84 U/mL、9.06 U/mL，在同一子集中，表明兩者對產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，48 h時，酶活均值為14.66 U/mL，與前兩者分屬不同子集，表明48 h時，產(chǎn)脂肪酶活效果最好；同時椰子油、葵花籽油也可誘導(dǎo)該菌株產(chǎn)生較高的酶活。
圖5碳源對產(chǎn)酶的影響
產(chǎn)脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件研究（一）
產(chǎn)脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件研究（二）
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