?食源性致病菌：微生物群體延滯期特點與測定方法
生長曲線群體生長延滯期的測定
目前微生物延滯期仍未基于微生物生長機理明確定義，生物學上被普遍接受的定義是：微生物群體經(jīng)歷環(huán)境突變，自我調(diào)整后開始繁殖的時間。幾何意義上微生物延滯期是指微生物對數(shù)生長期達到最大比生長速率時，生長曲線切線的反向延長線和初始菌量水平延長線的交點在時間軸上的投影點與零時刻的時間間隔。
基于微生物生長延滯期的測定方法，微生物群體延滯期需通過生長模型擬合生長曲線間接獲取。
微生物培養(yǎng)在延滯期有以下特點：
（1）細胞物質(zhì)開始增加；
（2）有的細胞因不適應環(huán)境而死亡；
（3）微生物細胞總數(shù)有所下降；
（4）延滯期末期，細胞代謝活動能力開始增強，并開始細胞分裂。
目前測定微生物生長曲線的方法主要分為傳統(tǒng)方法和分子生物學方法。表1中總結(jié)了應用傳統(tǒng)方法和分子生物學方法測定微生物生長曲線進而通過模型擬合獲取生長延滯期的相關(guān)研究。傳統(tǒng)測定微生物生長曲線的方法是活菌計數(shù)法，因其不受菌懸液顏色及濁度的影響而成為測定食品中食源性致病菌的主流手段。但是該方法操作繁瑣、耗時耗力，且應用該方法獲取的生長參數(shù)準確性與數(shù)據(jù)點的數(shù)量及觀測點的位置均相關(guān)，因此活菌計數(shù)法還需進一步改進。相較于活菌計數(shù)法，比濁法因其操作簡便、省時省力的優(yōu)點被廣泛應用于微生物生長曲線的測定和建模研究中。然而，比濁法的檢測限僅能達到106～107CFU/mL，且只可用于液體培養(yǎng)基的測定，同時因測定的菌懸液濃度并不是活菌濃度而導致獲得的生長參數(shù)有些許誤差。建議今后的研究可基于技術(shù)層面對該方法進行優(yōu)化，使其能更好地描述低濃度食源性致病菌的生長，為進一步研究微生物生長提供依據(jù)。
表1應用各種方法測定食源性致病菌生長曲線的相關(guān)研究
隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)和PCR等分子生物學技術(shù)也被應用于微生物生長曲線的測定，相較于傳統(tǒng)方法，這些分子生物學技術(shù)具有省時省力、高效等優(yōu)點，且可同時測定兩種細菌的生長，極大地改善了傳統(tǒng)方法的不足。應用DGGE結(jié)合PCR技術(shù)測定了單增李斯特菌和副溶血性弧菌的生長情況，進而通過Baranyi模型擬合其生長曲線獲取延滯期。傳統(tǒng)PCR技術(shù)需結(jié)合DGGE技術(shù)才可定量測定微生物的生長情況，而實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技術(shù)的出現(xiàn)彌補了其缺陷，實現(xiàn)了從定性到定量的突破。將金黃色葡萄球菌的菌液接種于豬肉中進行培養(yǎng)，每隔一段時間提取生長后細菌的總基因組DNA，并對其進行qPCR分析，進而根據(jù)已建立的微生物濃度與qPCR的循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值間的標準曲線，定量描述豬肉中金黃色葡萄球菌的生長情況，最后應用模型擬合其生長曲線，間接獲取生長延滯期。同樣應用qPCR技術(shù)分別定量描述了豬肉中單增李斯特菌和即食南美白對蝦中副溶血性弧菌的生長情況，并對其進行模型擬合，獲取了延滯期。但因qPCR技術(shù)無法區(qū)分活菌和死菌，導致實驗結(jié)果有一定的誤差?；诖?，將疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）與多重qPCR技術(shù)相結(jié)合，極好地定量描述了生鮮南美白對蝦樣品中副溶血性弧菌和單增李斯特菌的生長行為。雖然PMA的應用可區(qū)分活死菌，但其會對細菌產(chǎn)生一定的損傷。分子生物學技術(shù)的發(fā)展為預測微生物學注入了新的活力，加速了預測微生物學的發(fā)展。然而，任何方法均需辯證地看待，即每一種方法均各有優(yōu)點和局限性，因此分子生物學技術(shù)并不能完全取代傳統(tǒng)方法，仍需根據(jù)具體的實驗目的選擇合適的實驗方法。
綜上所述，雖然微生物群體延滯期和單細胞延滯期均可采用上述方法間接獲得，但是微生物群體延滯期會因擬合模型不同而不同，同時微生物單細胞生長觀測方法依然存在精度低、控制難、耗時長等問題。
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