熒光分光光度法測定硫酸鹽還原菌SRB菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線、生長曲線
煤層氣生物工程技術(shù)是通過往煤層中注入激活劑或者微生物來產(chǎn)生以甲烷為主要成分的氣體的生物增采技術(shù)，具有很好的應(yīng)用前景。煤的生物產(chǎn)氣環(huán)境中，微生物為了從煤中獲取能源底物會選擇性吸附到煤表面形成生物膜，其吸附成膜是微生物啟動煤厭氧降解產(chǎn)氣的先決條件，也是煤厭氧降解產(chǎn)氣過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過調(diào)控微生物在煤表面的吸附率，可以促進煤的生物產(chǎn)氣量。
硫酸鹽還原菌是煤厭氧降解產(chǎn)氣體系中重要的功能微生物種群，在煤厭氧降解生物產(chǎn)氣前可以在煤表面形成生物膜，改變煤的表面性質(zhì)，影響煤表面有機成分含量及物質(zhì)結(jié)構(gòu)，為體系中其他產(chǎn)甲烷功能菌提供豐富的前體物質(zhì)，在產(chǎn)氣體系中發(fā)揮關(guān)鍵作用。改變煤表面吸附微生物的數(shù)量，可以影響煤的厭氧降解產(chǎn)氣效率。因此，如何快速準(zhǔn)確測定微生物在煤表面的吸附率對了解煤表面生物膜的形成過程，強化煤層氣的產(chǎn)生效率具有重要意義。
目前表征微生物在礦物表面吸附的方法有比濁法、茚三酮比色法，分光光度計法等，這些方法主要用來檢測好氧微生物在礦物表面的吸附。而煤生物厭氧降解產(chǎn)氣體系中的微生物均是厭氧微生物，對氧氣敏感，并且煤經(jīng)微生物厭氧降解后會形成微米級的煤顆粒，這會對傳統(tǒng)的測定好氧微生物在礦物表面吸附率的方法造成干擾。所以，需要開發(fā)一種能適合測定厭氧微生物如硫酸鹽還原菌在煤表面吸附率的方法。
通過特異性的熒光染料與微生物結(jié)合可避免煤顆粒對吸光度的干擾。但是，熒光測定體系的準(zhǔn)確度會受到多種因素影響，為了提高其準(zhǔn)確度，需要開發(fā)出合適的測試體系。
為了解決測定厭氧微生物硫酸鹽還原菌在煤表面吸附率問題，下面通過正交試驗法優(yōu)化了熒光分光光度法的測試體系，通過SRB菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線、生長曲線和在褐煤表面吸附率的測定進行方法驗證，表明該方法具有特異性強、準(zhǔn)確度和精密度都較高的優(yōu)點。
熒光分光光度法測定硫酸鹽還原菌培養(yǎng)體系中菌液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線
在厭氧手套箱中，將對數(shù)生長期的SRB培養(yǎng)液按照10％接種量接種到新的厭氧培養(yǎng)瓶中，接種完成后進行SRB細(xì)胞培養(yǎng)，每隔24h取出1.5mL樣品，按照步驟7中最優(yōu)條件測定樣品中細(xì)胞的熒光強度；同時用血細(xì)胞計數(shù)板法計數(shù)分析培養(yǎng)液中SRB的細(xì)胞濃度；以時間為橫坐標(biāo)，菌體濃度和熒光強度為縱坐標(biāo)，在同一坐標(biāo)軸內(nèi)建立熒光強度隨時間變化曲線及SRB細(xì)胞濃度隨時間變化的生長曲線，驗證熒光強度與細(xì)胞濃度變化的對應(yīng)關(guān)系。
通過在厭氧環(huán)境下對待測樣品進行處理，使用熒光分光光度法并控制吖啶橙與十二烷基磺酸鈉用量對硫酸鹽還原菌的熒光值進行測定。通過使用密閉比色皿可以保持在檢測過程中的厭氧環(huán)境，維持厭氧菌活性，結(jié)合血細(xì)胞計數(shù)板法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可實現(xiàn)硫酸鹽還原菌在煤表面吸附率的快速測定。該方法可實現(xiàn)對厭氧環(huán)境中微生物數(shù)量的快速檢測，并保持微生物活性，適用于多種類型的厭氧微生物，具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點。
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