婁地青霉菌分生孢子萌發(fā)的培養(yǎng)基用丙氨酸和精氨酸，τ最長可達(dá)33.5小時
婁地青霉菌因其用于生產(chǎn)藍(lán)紋奶酪而聞名，但它也是一種食物腐敗真菌，例如黑麥面包和乳制品。婁地青霉菌在高CO2濃度（高達(dá)84.8%）、低O2水平（低至0.3%）和低溫（低至0°C）下生長的能力使該物種與其他絲狀生物區(qū)分開來真菌并使其成為常見的腐敗真菌。婁地青霉菌有助于變質(zhì)通過空氣、水或其他載體分散大量稱為分生孢子的抗壓無性孢子。真菌分生孢子的萌發(fā)以活化、膨脹和胚管形成階段為特征97）。靜止分生孢子的激活導(dǎo)致孢子腫脹。在這個各向同性生長時期之后是極化生長，導(dǎo)致產(chǎn)生長出菌絲的胚管。到目前為止，婁地青霉菌的營養(yǎng)需求分生孢子未知。然而，已經(jīng)研究了水分活度(aw)、溫度和pH值對這些孢子萌發(fā)的影響。建模顯示婁地青霉菌分生孢子在-0.2至33°C的溫度下發(fā)芽，最佳溫度為26.9°C。最適pH值接近5.6，介于2.84和13.8之間，而水分活度(a w)的下限為0.83，最適pH值為0.98。當(dāng)暴露在最佳條件下10小時后開始發(fā)芽。分生孢子的萌發(fā)也受到分生孢子生產(chǎn)過程中條件的影響。例如低溫和低aw，但不是pH值，在孢子形成過程中顯著減少了發(fā)芽時間。在這里，本論文研究人員研究了婁地青霉菌分生孢子萌發(fā)的培養(yǎng)基要求。數(shù)據(jù)顯示，葡萄糖、丙氨酸和精氨酸可激活12-21%的分生孢子萌發(fā)。如果有的話，其他氨基酸在誘導(dǎo)發(fā)芽方面的效果要差得多。在所有情況下，在胚管形成之前，分生孢子的腫脹是最小的，甚至無法檢測到。
丹麥Biosense微生物生長動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)的應(yīng)用
在150μL NPS(70.6 mM NaNO3,11 mM Na2HPO4)的96孔懸浮培養(yǎng)的每孔中接種總數(shù)為6 10 3的孢子/NaH2PO 4(pH 6.0)、2 mM MgSO4)含有或不含有6.71 mM KCl和/或10 mM碳源（即葡萄糖或20種蛋白質(zhì)L-氨基酸中的一種）。MilliQ純水用作基線條件。使用oCelloScope(Biosense Solutions）在25°C下在線監(jiān)測分生孢子的萌發(fā)。使用UniExplorer軟件版本8.1.0.7682-RL2。培養(yǎng)1小時后開始測量（使用生物三次重復(fù)和技術(shù)重復(fù)），使分生孢子能夠沉降在井底。在前24小時內(nèi)每小時掃描一次物體，在接下來的48小時內(nèi)每2小時掃描一次。選擇其中的一個孔的一個子部分區(qū)域進(jìn)行分析。掃描區(qū)域長度設(shè)置為4,05，對象區(qū)域（最小-最大）設(shè)置為70-1500像素，最大對象數(shù)設(shè)置為1500。使用oCelloScope XY坐標(biāo)和自定義R腳本隨時間跟蹤單個對象。分生孢子聚集體和t處的非分生孢子對象=1 h從數(shù)據(jù)集中手動刪除。
實驗結(jié)論
評估了婁地青霉菌分生孢子在水或由NaNO3、Na2HPO 4/NaH2O4、MgSO4組成的確定培養(yǎng)基中的萌發(fā)情況和KCl(KNPS)補(bǔ)充或不補(bǔ)充葡萄糖或20種蛋白質(zhì)氨基酸之一。根據(jù)不對稱模型，在這些碳源中，只有葡萄糖、精氨酸和丙氨酸在72小時期間誘導(dǎo)發(fā)芽>10%。孢子的整體低發(fā)芽百分比（在精氨酸存在下獲得的最大百分比為21.18%）可以用低營養(yǎng)條件來解釋，因為麥芽提取物中的發(fā)芽導(dǎo)致高達(dá)90%的孢子發(fā)芽，這是相似的與麥芽提取物瓊脂上的發(fā)芽率相比。特別是在存在精氨酸和丙氨酸的情況下，部分孢子形成了沒有可檢測到的腫脹的胚管。在純水中也觀察到了婁地青霉菌的萌發(fā)。分生孢子可能不需要外部觸發(fā)器來開始發(fā)芽，但觸發(fā)器只是加速了這個過程。
圖1、用于描述青霉菌屬分生孢子在KNPS（6.71 mM KCl、70.6 mM NaNO3、11 mM Na2 HPO4/NaH2PO 4(pH 6.0)、2 mM MgSO 4）中形成胚芽管的不對稱模型，輔以10 mM精氨酸(A)、丙氨酸(B)、葡萄糖(C)、Milli-Q(D)作為對照。心點代表兩次技術(shù)重復(fù)的平均值。
圖2、非對稱模型的參數(shù)估計，用于描述婁地青霉菌芽管形成的芽管存在10mM葡萄糖(G)或10mM的蛋白質(zhì)源氨基酸(AA)之一的存在。
圖3、隨著時間的推移，在KNPS+精氨酸（紅色）、丙氨酸（綠色）或葡萄糖（藍(lán)色）中培養(yǎng)的婁地青霉菌的單個發(fā)芽分生孢子的像素中的Δ面積（面積t=x-面積t=1）。黑點顯示NPS+丙氨酸中正在發(fā)芽的A.niger分生孢子。
圖4、用oCelloScope(標(biāo)尺,15μm)檢測婁地青霉菌在KNPS+丙氨酸(a)、精氨酸(B)和葡萄糖(C)中的萌發(fā)情況。沉降1小時后開始成像，間隔1小時(1-23小時)和2小時(23-41小時)。
圖5、干酪乳桿菌分生孢子在麥芽提取物肉湯中的腫脹示意圖。箭頭表示腫脹的分生孢子。
總結(jié)
婁地青霉菌用于生產(chǎn)藍(lán)紋奶酪，但也是一種腐敗真菌。它通過形成分生孢子進(jìn)行無性繁殖。這些孢子的萌發(fā)可以開始食物的腐敗過程。發(fā)芽的典型特征是活化、膨脹和胚管形成過程。在這里，我們研究了婁地青霉菌分生孢子萌發(fā)的營養(yǎng)需求。研究中使用了oCelloScope微生物動態(tài)監(jiān)測系認(rèn)及時監(jiān)測在每種條件>300個分生孢子，并使用不對稱模型來描述發(fā)芽過程。孢子在NaNO3、Na2 PO 4/NaH2PO 4、MgSO 4中培養(yǎng)72小時和KCl與10 mM葡萄糖或20種蛋白質(zhì)氨基酸中的1種10 mM。在葡萄糖的情況下，形成胚管的最大孢子數(shù)(P max)為12.7%，而達(dá)到0.5 P max(τ)所需的時間約為14小時。精氨酸和丙氨酸是最具誘導(dǎo)性的氨基酸，其胚管形成的P max分別為21%和13%，τ最長可達(dá)33.5小時。與真菌分生孢子萌發(fā)的典型階段相反，數(shù)據(jù)顯示婁地青霉菌分生孢子可以在沒有可檢測到的腫脹階段開始形成胚管。
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